Gru mudou radicalmente sua vida e se dedica às filhotas Agnes, Edith e Margo, deixando de lado os tempos de vilão. Ele só não contava que seu passado fosse responsável pelo seu recrutamento pela Liga Antivilões para salvar o mundo na companhia da agente Lucy. Juntos, eles precisam localizar o criminoso que roubou a fórmula PX41 e Gru desconfia que seu antigo concorrente El Macho possa ser o responsável.

Metro City é uma metrópole reluzente, cuja localização fica no céu. É lá que o Dr. Tenma (Nicolas Cage) cria Astro Boy (Freddie Highmore), na intenção de substituir o filho que perdeu. Astro Boy possui poderes extraordinários, sendo dotado com o que há de melhor nas características humanas. Após ser expulso, por não conseguir cumprir as expectativas geradas por Tenma, Astro Boy precisa aprender a conviver como um robô e aceitar o fato de não ser humano. Ele passa a ser perseguido pelas tropas do presidente Stone (Donald Sutherland), que deseja tomar a fonte de energia que Astro Boy carrega dentro de si. Para escapar, ele cai na terra. Confuso e sem entender a nova realidade, ele resolve se passar por humano junto com um grupo de crianças de rua.