Cinco anos após os acontecimentos da série original, com 15 anos de idade, Benjamin "Ben" Tennyson voltou a uma vida cotidiana e normal. Quando a atividade alienígena parou de se manifestar em quantidade ameaçadora, Ben retirou o Omnitrix, cresceu e passou a ser um adolescente confiante. Mas quando Max desaparece, Ben resolve usar novamente o Omnitrix a fim de deter novos inimigos junto com Gwendolyn Tennyson e Kevin Ethan Levin para localizá-lo. Enquanto, ao mesmo tempo, contando com uma ajuda de filhos de Encanadores (com uma paz inter-planetária força de manutenção, ambos com os membros meio alienígenas e humanos) a repelir os ataques dos DNAliens e os Highbreed (br: Soberanos). Com a derrota dos Highbreed/Soberanos, Ben, Gwen e Kevin continuam suas aventuras lidando com várias ameaças alienígenas. Estas incluem um confronto direto com alguns vilões do passado de Ben, como Vilgax, Dr. Animal, Fantasmático, Encantriz e Vulkanus.

O relacionamento entre Peter Parker e Mary Jane parece estar dando certo, mas outros problemas começam a surgir. A roupa de Homem-Aranha torna-se preta e acaba controlando Peter, que apesar de aumentar seus poderes, revela o lado obscuro de sua personalidade. Os vilões Venon e Homem-Areia tentam destruir o super-herói.

Dois anos se passaram desde que o tranquilo Peter Parker (Tobey Maguire) separou-se do grande amor de sua vida, Mary Jane Watson (Kirsten Dunst), e decidiu assumir o compromisso e a responsabilidade de seguir sendo o Homem-Aranha. Peter enfrenta novos desafios enquanto aprende a lidar com "seu dom e sua maldição", tentando desesperadamente harmonizar suas duas identidades: A do super-herói aracnídeo, o Homem-Aranha, e a do estudante universitário.

Peter Parker é um jovem estudioso que vive com seus tios, Ben e May, desde que seus pais faleceram. Peter tem dificuldade em se relacionar com seus colegas, por ser tímido e por eles o considerarem um nerd. Até que, em uma demonstração científica, um acidente inesperado faz com que uma aranha modificada geneticamente pique Peter. A partir de então seu corpo é quimicamente alterado pela picada da aranha.